Маргарита Морозова «Популярная механика» №3, 2018
Шок и трепет перед посещением дантиста знакомы нам с детства. Да и у многих взрослых душа уходит в пятки от позвякивания инструментов, а порой — от одного только вида стоматологической клиники. В итоге, несмотря на все успехи современной медицины, надежды на будущее без кариеса практически не осталось. А ведь именно он вместе с пародонтитом является основной причиной потери зубов у людей всех возрастов. Проблема стимулирует поиски новых методов лечения, в том числе и в области биоинженерии. Методов, которые позволят забыть о пломбах и коронках и просто вырастить новые здоровые зубы вместо поврежденных.
Тканевую инженерию в стоматологии применяли еще в эпоху фараонов: древнейшие известные зубные имплантаты найдены археологами именно в Египте. Среди них есть и зубы, которые были реимплантированы женщине на место утерянных и частично интегрировались с живой тканью. В мужской челюсти обнаружился искусственный зуб, мастерски вырезанный из раковины моллюска еще 5500 лет назад. Но несмотря на внушительный срок, полноценного лечения пациента с адентией, то есть полной или частичной потерей зубов, не существует до сих пор.
История вопроса
около 330 до н.э. Аристотель описывает регенерацию кончика хвоста у ящерицы. 1950-е В костном мозге найдены два типа стволовых клеток: гемопоэтические предшественники кровяных телец и мезенхимальные предшественники костной и хрящевой ткани, включая зубы. 1981 Впервые выделены и выращены «в пробирке» эмбриональные стволовые клетки мышей. 1985 Стволовые клетки обнаружены в зубной пульпе человека. 1998 Успешная изоляция и культивирование в лаборатории эмбриональных стволовых клеток человека. 2000 Показано, что мезенхимальные стволовые клетки в пульпе способны регенерировать дентиноподобные тканевые комплексы. 2003 Удается выделить популяцию стволовых клеток из еще живых остатков разрушенного зуба. 2004 Обнаружение стволовых клеток в периодонтальной связке, которая удерживает зуб на месте. 2006 Зрелые дифференцированные клетки мышей успешно «перепрограммированы» в стволовые (индуцированные плюрипотентные) клетки. 2007 Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки получены из фибробластов человека. 2010 Из стволовых клеток пульпы на искусственном скаффолде выращены дентиноподобные комплексы.
Свои или искусственные
Ортопедические конструкции и имплантаты до некоторой степени компенсируют функции утраченного зуба, однако у этих искусственных заменителей отсутствуют сосуды, нервные окончания и рецепторы. Кроме того, они не образуют периодонтальную связку — слой соединительной ткани между корнем зуба и костью, формирующей стенку лунки. Периодонт способствует закреплению зуба в альвеоле и обеспечивает его механическую устойчивость: сила жевательных мышц человека составляет целых 390 кг, и связка распределяет это давление между зубами.
В отличие от зуба, имплантат неподвижен, а развитие вокруг него соединительной ткани часто заканчивается воспалением (периимплантитом) и требует удаления искусственного зуба. Кроме того, имплантат не может быть соединен в одну конструкцию с зубами пациента как раз из-за неспособности адекватного распределения давления ввиду отсутствия периодонта. Наконец, имплантированный заменитель требует куда более внимательного отношения к гигиене полости рта, что снова возвращает нас к основному источнику наших проблем, «человеческому фактору». Очевидно, идеальным решением была бы технология выращивания настоящих живых зубов, а не пересадка искусственных. Так давайте перейдем к делу.
Самый ранний признак развития зубов — образование дентальной пластинки, подковообразного утолщения эпителия, которое тянется вдоль верхней и нижней челюстей эмбриона. Пройдя через несколько этапов, она образует корни отдельных зубов. Координацию этого процесса обеспечивают как минимум четыре эпителиальных сигнальных центра, клетки которых выделяют вещества, регулирующие формирование зуба.
Все перечисленное выше пригодится нам и для создания новых зубов методами тканевой инженерии. «Рецептура» выращивания любой биологической ткани требует трех базовых компонентов: стволовых клеток, внеклеточного матрикса (скаффолда, который предоставляет опору для развивающихся клеточных структур) и, наконец, факторов роста, объединенных в необходимые для развития зуба сигнальные пути. Пойдем по порядку и начнем с главных героев — стволовых клеток, обладающих одонтогенной компетентностью и способных развиться в ткани зубов.
Зубное возрождение
Современный классик русской литературы Виктор Пелевин шестнадцать лет назад напомнил читателям, что при нахождении в неприятной ситуации можно выбрать одну из двух стратегий: выяснить причины попадания в эту ситуацию или же предпринять действия, помогающие ее покинуть. Предпочтительнее вторая стратегия, но далеко не всем удается ею воспользоваться.
Действительно, об эволюции человека и о том, что сгубило его зубы, можно спорить, моделировать, но так и не прийти к окончательному решению. Куда полезнее было бы научиться лечить зубы не только пломбами и выращивать на месте погибших зубов новые вместо того, чтобы залатывать черные кариозные дыры безжизненными протезами. Еще — но это уже вишенка на торте — было бы хорошо уметь останавливать рост тех зубов, которые на челюсти заведомо не поместятся.
Но зубы устроены сложнее, чем кажется на первый взгляд, и поэтому собрать такой орган в пробирке не так-то просто. Каждому зубу дают начало клетки множества типов, главные из которых — амелобласты, благодаря которым формируется зубная эмаль, одонтобласты, дающие начало слою под эмалью (дентину), и цементобласты, производящие цемент — одно из средств закрепления зуба в челюсти. Первые происходят из наружного листка клеток зародыша — эктодермы, а вторые и третьи — из особого образования под названием нервный гребень. Его порой называют четвертым зародышевым листком: всего таких листков обычно выделяют три, но очень уж нервный гребень от них отличается. Выходит, что соседние структуры в рамках одного зуба имеют не больше общего, чем волосы и нервы.
И это еще не все. Полностью сформированные зубы содержат клетки иммунной системы (макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы и прочие), рецепторы температуры и давления… Предшественники у всех этих непохожих друг на друга клеток разные, их нужно смешивать в определенных пропорциях, плюс еще найти вещества, которые позволяют им примириться с необычными соседями и как ни в чем не бывало выполнять свои функции. Поэтому создать человеческий зуб вне организма пока так никто и не смог.
Но не обязательно производить части организма вне его. Природа справится сама: теоретически можно заставить челюсти самостоятельно вырастить новые зубы. Этот трюк можно провернуть по крайней мере с мышами, у которых по сравнению с нами зубов гораздо меньше: 16 против 32 (у них не хватает клыков и ложных коренных, то есть премоляров).
Оказалось, что если грызуну «выключить» ген Usag-1
,
Spry2
или
Spry4
, у него вырастет больше 16 зубов. Биологи из Киотского университета предполагают, что подобным образом можно будет лечить нехватку зубов у человека: ввести в то место, где хорошо бы образовать новый зуб взамен утраченного, молекулярный коктейль из ингибиторов определенных генов и тем самым запустить генерацию зубов третьей смены — ну или первой и второй, если исследователи имеют дело с врожденной нехваткой зубов.
Так можно было бы создавать целые новые зубы (сверху) или отдельные их корни (снизу)
L. Hu, Y. Liu, S. Wang / Oral Diseases, 2017
Поделиться
Дентальные стволовые клетки
В отличие от большинства зрелых клеток, стволовые клетки способны проходить через множество делений и понемногу специализироваться, формируя клетки разных типов. Эмбриональные стволовые клетки тотипотентны и могут превратиться в любой из более чем 200 видов клеток взрослого организма. Постнатальные стволовые клетки сохраняются и в тканях взрослого организма. Они мультипотентны, то есть способны дать начало лишь определенным типам клеток, и локализуются в соответствующих тканях, будь то костный мозг, кровеносные сосуды, печень, кожа или дентальные ткани.
В зависимости от локализации дентальные стволовые клетки (ДСК) подразделяются на стволовые клетки пульпы, удаленных молочных зубов, периодонтальной связки, десны, клетки предшественников зубного фолликула и т. д. Это дает нам немало возможностей их заполучить. Стволовые клетки пульпы можно выделить прямо из удаленных зубов — это удобный и перспективный источник ДСК, подходящих для восстановления как дентина, пульпы и цемента, так и костной ткани. Помимо этого, они проявляют выраженную нейрорегенеративную активность, ингибируя гибель нейронов, астроцитов и олигодендроцитов после травмы, ускоряя восстановление поврежденных аксонов. Популяция стволовых клеток удаленных молочных зубов может дифференцироваться в клетки костной и нервной тканей, а ДСК десны подходят для восстановления пародонта, мышц и даже сухожилий.
Механизмы развития одонтогенных стволовых клеток окончательно не выяснены, однако идентифицировано уже более 200 работающих в них генов. Понятно, что каждый тип ДСК имеет свои особенности, которые обещают им применение не только в стоматологии, но и в других областях медицины. Другим ресурсом стволовых клеток для выращивания зубов остаются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные «перепрограммированием» взрослых дифференцированных клеток за счет обработки специальным коктейлем сигнальных молекул. Ученые продолжают развивать безопасные методы создания ИПСК и их использования.
Межклеточный матрикс
Но ресурс стволовых клеток для выращивания зубов еще даже не полдела. Для развития и образования сложной структуры зрелой ткани требуется опора, скаффолд из молекул межклеточного матрикса: именно он поддерживает прикрепление, миграцию и пространственную организацию клеток. Просветы и поры в нем обеспечивают движение клеток, ростовых факторов и обмен веществ. Искусственный скаффолд должен быть прост в использовании, обладать биосовместимостью, способностью к деградации в организме и низкой иммуногенностью, хорошими механическими свойствами и т. п.
Среди синтетических материалов для формирования скаффолда стоит упомянуть «биоактивное» стекло, которое может срастаться с биологическими тканями, полимолочную кислоту и композиты на основе металла, керамики или полимеров. Все они позволяют изготовлять скаффолды необходимой формы, хотя их применение остается весьма ограниченным из-за низкой биосовместимости и токсичности. В противоположность им натуральные биоматериалы для скаффолдов — такие как коллаген, хитозан или гиалуроновая кислота — биосовместимы и легко биодеградируются. Однако они менее прочны и способны вызывать реакции отторжения.
В любом случае идеальным материалом для скаффолда будет структура, полученная непосредственно из натуральных полимеров внеклеточного матрикса или из их синтетических аналогов. Росшие на таком скаффолде стволовые клетки пульпы и периодонта при обработке соответствующими сигнальными веществами успешно развивались в одонтогенном направлении — к образованию тканей зуба. Впрочем, к этому мы еще вернемся, а пока нам нужен третий вид ингредиентов.
Сигнальные пути
Стволовые клетки — наш основной ресурс, скаффолд — основа его развития, но дирижировать их взаимодействием должны сигнальные молекулы, включая факторы роста и интерферирующие РНК. Факторы роста — это молекулы пептидов, передающие сигналы для управления клеточным поведением через воздействие на специфические рецепторы на поверхности клеток. Они обеспечивают взаимосвязь и взаимодействие между клетками, а также между ними и внеклеточным матриксом. Так, если кариозная полость оказалась близко к чувствительной пульпе или у пациента наблюдается повышенная стираемость зубов, соответствующие факторы роста запускают образование вторичного и третичного дентина. Идентифицирован и целый ряд факторов роста, действующих во время развития зубов, таких как костный морфогенетический белок (BMP), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и фактор роста фибробластов (FGF). Их доставляют к стволовым клеткам с помощью наночастиц или через сам скаффолд, заполняя его нужным набором молекул.
Для контроля над дифференцировкой клеток используют и молекулы интерферирующей РНК. Они связываются с матричной РНК и останавливают синтез того или иного белка. Для целевой доставки такую РНК превращают в ДНК и в виде плазмиды переносят в клетку. Теперь у нас есть все необходимое для получения зуба: дентальные стволовые клетки (в ассортименте), скаффолд (продукт, идентичный натуральному) и факторы роста (по вкусу).
Итог
До выращивания человеческих зубов в пробирке, увы, еще далеко — по меньшей мере десятки лет. Однако есть надежда, что в ближайшие годы найдется способ заставлять челюсти создавать новые зубы: для этого нужно будет прицельно воздействовать на те места, где мы хотим увидеть новые зубы, набором активаторов и глушителей генов, связанных с ростом зубов.
Некоторые из этих генов уже известны, а открыть другие помогут, к примеру, «зубные атласы» — списки всех популяций клеток в составе зрелых и формирующихся зубов с указанием их молекулярных особенностей. Один такой список для людей и мышей составила в 2020 году группа выходца из России Игоря Адамейко.
Хотя создавать полноценные живые замены компонентам наших зубов пока не получается, сам поиск зубных стволовых клеток оказался весьма полезным. Клинические исследования различных групп таких клеток уже проводят, и некоторые из них дают обнадеживающие результаты.
Светлана Ястребова
Рецепт готов
Базовые принципы тканевой инженерии зубов уже разработаны, и попытки перейти к применению на практике предпринимаются больше полутора десятков лет. Пионерами в выращивании зубов можно назвать английских ученых, которые приступили к таким исследованиям еще в 2002 году. И хотя их эксперименты по регенерации твердых зубных тканей особого результата не принесли, уже вскоре ученые из команды Такаши Цуи провели более успешные опыты, продлившиеся около двух лет. После решения ряда проблем им удалось выделить дентальные стволовые клетки из мышиных эмбрионов, «собрать» из них биоинженерный зачаток, вырастить из него полноценный зуб и имплантировать его в челюсть мыши.
Протокол, подготовленный японскими специалистами в ходе этой работы, стал одним из ключевых руководств, которыми пользуются ученые для экспериментов в области тканевой инженерии. На него опирались и российские ученые из стоматологического университета имени Евдокимова (МГМСУ): в 2022 году им удалось провести собственные успешные опыты по выращиванию мышиных зубов. Человеческие зубы более сложны и громоздки, и вырастить их пока не удается. Остаются нерешенными проблемы, связанные с иннервацией и кровоснабжением «биоинженерного» зуба, его связочным аппаратом, а главное — с выбором пула стволовых клеток.
Дело в том, что получить человеческие ДСК можно из здорового зуба (повредив его) или из зуба с удаленной пульпой. Доступные же клетки — такие, как стволовые клетки десны, — не обладают одонтогенной способностью. Научиться получать нужные ДСК из имеющихся ресурсов или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пока только предстоит. Однако нет сомнений в том, что через некоторое время биоинжиниринг зубов поможет и взрослым, и детям окончательно забыть о трепете перед визитом к стоматологу.
Технология выращивания зубов. Мифы и реальность.
Уже многие годы человечество не просто мечтает о бессмертии и технологиях, позволяющих избавляться от любых заболеваний и устранять различные дефекты, но и упорно работает в этом направлении. Стремительно развивающаяся биоинженерия обещает нам массу удивительного и интересного, в том числе дает надежду на то, что вместо пораженных, разрушенных и утраченных зубов можно будет выращивать новые, абсолютно полноценные коренные зубы и не прибегать к установке искусственных корневых имплантов и к зубопротезированию.
Учеными уже обнаружен ген, ответственный за рост зубов и формирование эмали, а также проведен ряд довольно успешных исследований по выращиванию зубов в лабораторных условиях для мышей и крыс. Однако и по сей день нет достоверных фактов, подтверждающих возможность переноса этих технологий на человека и готовность подобных методов к широкому внедрению в мировую стоматологию.
Японскими учеными официально обнародованы успешные результаты эксперимента, в ходе которого из мезенхимальных и эпителиальных клеток мыши (клеток, стоящих немного выше, чем стволовые, т. е. более дифференцированных) они вырастили новый зуб. Для этого клеточный материал был помещен в специальный коллагеновый каркас и применены особые технологии выращивания новых тканей.
Ученым действительно удалось вырастить новый зуб, состоящий из дентина, пульпы, эмали и имеющий сосуды и периодонтальные ткани. Этот зуб, размером всего 1,3мм, а точнее – зубной зачаток, был подсажен восьминедельной мыши в лунку только что удаленного под анестезией резца. Обследование, выполненное по истечении двух недель, показало, что новый зуб хорошо прижился и начал расти и функционировать так же, как обыкновенные, природные зубы мыши, ничем не отличаясь от них ни по прочности, ни по строению, ни по внешнему виду.
Таким образом, специалисты полностью заменили зуб животного биоинженерными материалами. Для того чтобы наблюдение за растущим зубом было более точным и четким, в клетки ученые добавили ген флуоресцентного протеина зеленого цвета. Благодаря этому можно было видеть, как именно происходило деление клеток и судить о том, насколько правильным был этот процесс.
Специалисты утверждают, что проведенная работа является отличной основой для дальнейших исследований в этом направлении. В будущем планируется не просто выращивать в лабораторных условиях («in vitro») новые зубы для человека, а использовать для этого, как минимум, два метода:
- наружный − новый зуб полностью выращивается вне организма и затем имплантируется пациенту;
- внутренний − новый зуб растет непосредственно в ротовой полости пациента из подсаженных и предварительно обработанных в лабораторных условиях клеток.
На сегодняшний день перед специалистами, занимающимися проблемой выращивания новых зубов при помощи биоинженерных технологий, стоит несколько задач. Прежде всего, ученым необходимо:
- усовершенствовать процесс деления клеток таким образом, чтобы в итоге добиться формирования зубов с натуральным соотношением эмали, дентина и пульпы;
- гарантировать, что новый зуб будет иметь нужный размер и форму, т. е. что на месте резца не вырастет жевательный зуб и наоборот;
- добиться высокого процента приживляемости подсаживаемого биоинженерного материала.
